Аллельные варианты генов-кандидатов подверженности туберкулезу у русского населения Западной Сибири

Таблица 4Структура материала популяционных выборок г. Томска и Томской области, изученных по полиморфным ДНК-маркерам генов NRAMP1, VDR, IL1B, IL12B, IL1RN

Ген	Полиморфизм	Выборка больных туберкулезом	Выборка здоровых индивидов
NRAMP1	469+14G/C	279	137
	D543N	278	139
	1465-85G/A	279	135
	274C/T	299	116
IL12B	1188А/С	279	129
VDR	B/b	293	108
	F/f	298	113
IL1B	+3953A1/A2	301	139
IL1RN	VNTR	299	140

1

Таблица 5 Характеристики исследованных полиморфизмов

Ген	Полимор-физм	Структура праймеров	tо отжига прай-меров, оС	Фермент рестрик-ции	Продукты гидролиза, п. н.	Литература
					Аллель «дикого» типа	Мутантный аллель
NRAMP1	274C/T	5'-tgccaccatccctatacccag -3' 5'-tctcgaaagtgtcccactcag -3'	60	Mnl I	167;37;12 bp	102;65;37;12 bp	Liu J. et al., 1995
	469+14G/C	5'-tctctggctgaaggctctcc -3' 5'-tgtgctatcagttgagcctc - 3'	60	Apa I	624 bp	455;169 bp
	1465-85G/A	5'-gcaagttgaggagccaagac -3' 5'-acctgcatcaactcctcttc -3'	60	Bsе 1I	142;75;24 bp	102;75;40;24 bp
	D543N	5'-gcatctccccaattcatggt -3' 5'-aactgtcccactctatcctg -3'	60	Bme 18I	126;79;39 bp	201;39 bp
IL12	A1188C	5'-ttctatctgatttgcttta -3' 5'-tgaaacattccatacatcc -3'	43	Taq I	233 bp	165;68 bp	Hall M. A. еt al., 2000
VDR	B/b	5'-aacttgcatgaggaggagcatgtc-3' 5'-ggagaggagcctctgtcccatttg-3'	60	Pct I	813 bp	505;308 bp	Wilkinson R.J. et al., 2000
	F/f	5'-agctggccctggcactgactctgctct-3' 5'-atggaaacaccttgcttcttctccctc-3'	60	Fok I	267 bp	197;70 bp
IL1B	+3953A1/A2	5'-gttgtcatcagactttgacc-3' 5'-ttcagttcatatggaccaga-3'	58	Taq I	220 bp	148; 72 bp	Wilkinson R.J. et al., 1999
IL1RN	VNTR	5'-tcctggtctgcaggtaa-3' 5'-ctcagcaacactcctat-3'	60	А1-410 п.о. (4 повтора); А2-240 п.о. (2 повтора) А3-500 п.о. (5 повторов); А4-325 п.о. (3 повтора) А5-595 п.о. (6 повторов)	Tarlow J.K. et al., 1993

2.2.3 Генетико - статистические методы анализа

Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга (РХВ) с помощью точного теста Фишера [Вейр Б., 1995]. Рассчитывали ожидаемую гетерозиготность полиморфизма генов NRAMP1, IL12B, VDR, IL1B, IL1RN [Nei M., 1975]. Относительное отклонение ожидаемой гетерозиготности от наблюдаемой (D) рассчитывали по формуле:

D=(hobs-hexp)/hexp,

где hobs и hexp - ожидаемая и наблюдаемая гетерозиготность соответственно.

Для анализа ассоциации маркеров исследуемых генов с туберкулезом, а также с качественными патогенетически важными признаками заболевания, сравнивали частоты аллелей и генотипов в группах больных и здоровых индивидов, используя критерий ?2 с поправкой Йетса на непрерывность. При численностях генотипов менее пяти использовали точный тест Фишера. В дополнение к этому об ассоциации разных генотипов (или их комбинаций) с заболеванием судили по величине отношения шансов (odds ratio (OR)), которая показывает, во сколько раз выше вероятность заболеть для индивида с определенным генотипом (или комбинацией генотипов) [Pearce N., 1993].

OR= (A/B)/(C/D), где

А - число (процент) людей с данным генотипом (комбинацией генотипов) в группе больных;

С - число (процент) людей с данным генотипом (комбинацией генотипов) в группе здоровых;

В - число (процент) индивидов, не имеющих данного генотипа (комбинации генотипов) в группе больных;

D - число (процент) индивидов, не имеющих данного генотипа (комбинации генотипов) в группе здоровых.

Значения OR>1 указывают на возможную положительную ассоциацию с заболеванием. Обсуждение величин OR проводили при уровне значимости не более 5%.

На материале семейной выборки больных изучение ассоциаций полиморфизма исследованных генов с туберкулезом проводили с использованием теста на неравновесие при переносе (Transmission/Disequilibrium Test, TDT), который в случае диаллельного маркерного локуса М сводится к анализу таблицы сопряженности 22, где в ячейках матрицы суммированы случаи наследования и не наследования от родителей больными детьми маркерных аллелей [Spielman R. S. et al., 1993].

a - число случаев наследования аллеля М1 от родителей М1М1;

b - число случаев наследования аллеля М1 от родителей М1М2;

c - число случаев наследования аллеля М2 от родителей М1М2;

d - число случаев наследования аллеля М2 от родителей М2М2;

Используются данные только от гетерозиготных родителей. Статистика теста рассчитывается по формуле:

TDT=(b-c)2/(b+c)

и в случае верной нулевой гипотезы (Н0: нет ассоциации) асимптотически распределена как ?2 с 1 степенью свободы.

С целью выявления ассоциации маркеров исследуемых генов с количественными, патогенетически важными признаками туберкулеза, проводили сравнение средних значений уровней метрических показателей у носителей разных генотипов с помощью однофакторного дисперсионного анализа по Фишеру и теста LSD. При наличии зависимости признака от пола показатели анализировались отдельно в группе мужчин и женщин. В случае влияния возраста на количественный параметр проводилась его корректировка, которая осуществлялась с помощью уровня линейной регрессии и рассчитывалась по формуле [Лильин Е.Т. и др., 1984]:

y=x+b(t0 -t),

где y - коррегированное значение исходной величины (х) признака;

t - возраст индивида

t0 - определенный возраст, к которому приводятся все значения;

b - коэффициент линейной регрессии признака по возрасту, который рассчитывается по формуле:

b=rxt/st2

где rxt - коэффициент корреляции признака с возрастом;

st - стандартное отклонение возраста в выборке.

Проверку на нормальность распределений осуществляли с помощью критерия Колмогорова-Смирнова и Лилифорса. В случае неравных дисперсий использовали непараметрические тесты Манна-Уитни, Краскела-Уоллиса и медианный тест [Лакин Г.Ф., 1990]. Сравнение дисперсий проводили по критерию Левене.

Расчеты гаметического неравновесия между парами молекулярно-генетических маркеров проводили по Hill W. G. (1974). Все расчеты осуществляли с помощью программ "STATISTICA for Windows 6.0" и "Microsoft Excel 7.0".

3. Результаты и обсуждение

Учитывая поставленные задачи, исследование включало три аспекта: изучение популяционной распространенности полиморфизма генов NRAMP1, IL12B, VDR, IL1B, IL1RN, анализ связи исследованных генов с туберкулезом и поиск ассоциаций с патогенетически важными параметрами заболевания у русских жителей г. Томска. К настоящему времени получены результаты исследования аллельных вариантов генов подверженности к ТБ у тувинцев, выполненного по аналогичной схеме и с использованием того же набора полиморфизма генов [Рудко А.А. и др., 2003]. Это дало возможность провести сравнение полученных результатов между русскими жителями г. Томска и тувинцами.

3.1 Распространенность полиморфизма генов NRAMP1, IL12B, VDR, IL1B, IL1RN среди здоровых лиц (контрольная группа)

В настоящее время во многих популяциях мира достаточно широко исследованы полиморфные варианты гена NRAMP1, и в меньшей степени изучена распространенность аллелей генов VDR, IL12B, IL1B, IL1RN [Рудко А.А. и др., 2003; Имангулова М.М. и др., 2004; Bellamy R. et al., 1998; Ryu S. et al., 2000; Cervino A.C.L. et al., 2000;. Gao P. S., 2000; Baghdadi J. et al., 2004; Liu W. et al., 2004;]. Результаты исследований показали, что полиморфизм этих генов вносит вклад в возникновение туберкулеза.

Однако известно, что восприимчивость к инфекционному заболеванию определяется одновременно многими генами с различным вкладом каждого из них в формирование того или иного патологического фенотипа. К тому же, один и тот же ген может участвовать в формировании чувствительности (или резистентности) к нескольким инфекционным заболеваниям. Вероятно, для каждого гена (и их ансамблей) существует свое "поле действия", которое модифицируется средой [Пузырев В.П., 2000]. Сочетания генов предрасположенности к болезни могут быть неодинаковы в популяциях, обусловливая различия в подверженности к заболеванию у разных народов. В связи с этим перспективным направлением исследований генетических основ предрасположенности к туберкулезу является изучение вкладов конкретных сочетаний аллелей в подверженность к болезни в различающихся как по расовой, так и по этнической принадлежности популяциях.

У здоровых жителей г. Томска распределение генотипов по всем изученным полиморфным вариантам гена NRAMP1 (469+14G/C, D543N, 1465-85 G/A, 274 C/T), VDR (B/b, F/f), а также генов интерлейкинов (полиморфизм 1188A/C гена IL12B, полиморфизм +3953 A1/A2 гена IL1B) соответствовало ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга (РХВ), причем для большинства полиморфизмов наблюдаемая гетерозиготность (Hobs) превышала ожидаемую (Hexp) (табл.6). Лишь для частот генотипов VNTR полиморфизма гена IL1RN показано отклонение от ожидаемых при РХВ (?2=16,75 р=0,010). При этом наблюдаемое количество гомозигот А2А2 превышало ожидаемое в 2,5 раза, а уровень гетерозиготности был меньше ожидаемого (D= -0,280). Возможно, этот факт объясняется тем, что анализируемая популяционная группа индивидов была выбрана не случайным образом из общей популяции, а включала только здоровых в отношении туберкулезной инфекции.

Сравнение распространенности полиморфизма генов NRAMP1, IL12B, VDR, IL1B, IL1RN у здоровых от туберкулеза русских и тувинцев показало статистически значимые отличия между этими этническими группами, которые имели место в распределении, как частот аллелей, так и генотипов по большинству изученных генов (табл. 7). Максимальные отличия между сравниваемыми этническими группами выявлены для полиморфизма B/b гена VDR, VNTR полиморфизма гена IL1RN и 1188А/С гена IL12B.

Таблица 6 Частоты аллелей и генотипов исследованных генов у здоровых жителей г. Томска

Ген	Поли-морфизм	Гено-типы	N.O.	N.E.	Частота аллеля	?2 (df)	Hobs	Hexp	D
NRAMP1	469+14 G/C	GG GC CC	97 38 2	98,22 35,56 3,22	G= 0,847	0,44 (1)	0,277	0,260	+0,069
	D543N	DD DN NN	127 12 0	127,26 11,48 0,26	D= 0,957	0,01 (1)	0,086	0,083	+0,045
	1465-85 G/A	GG GA AA	73 47 15	68,98 55,04 10,98	G= 0,715	2,60 (1)	0,348	0,408	-0,146
	274C/T	CC CT TT	80 34 2	81,11 31,78 3,11	C= 0,836	0,37 (1)	0,293	0,274	+0,070
IL12B	1188 A/C	AA AC CC	85 43 1	87,92 37,15 3,92	A= 0,826	2,75 (1)	0,333	0,288	+0,157
VDR	B/b	BB Bb bb	19 63 26	23,61 53,77 30,61	b= 0,532	2,93 (1)	0,583	0,498	+0,172
	F/f	FF Ff ff	42 54 17	42,13 53,73 17,13	F= 0,611	0,00 (1)	0,478	0,476	+0,005
IL1B	+3953 A1/A2	A1A1 A1A2 A2A2	90 44 5	90,24 43,51 5,24	A1= 0,806	0,00 (1)	0,317	0,313	+0,011
IL1RN	VNTR	A1A1 A1A2 A1A3 A1A4 A2A2 другие	93 27 4 3 12 1	86,49 40,94 3,96 2,20 4,84 1,57	A1= 0,786 A2= 0,186 A3= 0,018	16,8* (6)	0,250	0,347	-0,280

Примечание. N.O. и N.E. - наблюдаемая и ожидаемая численности генотипов соответственно; ?2 - критерий для сравнения ожидаемого и наблюдаемого распределения генотипов; d.f. - число степеней свободы; Hobs и Hexp - соответственно наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность; D - относительное отклонение наблюдаемой гетерозиготности от ожидаемой; * - p < 0,05

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12