Криоконсервации спермы русского осетра и севрюги

Сперму от самцов русского осетра и севрюги отбирали методом сцеживания. Ее до замораживания хранили в холодильнике при t = +4°С. Время хранения от 1.5 часов до 2 суток.

Перед замораживанием сперму первоначально смешивали с одним из образцов криопротектора, затем смесь оставляли на эквилибрацию (до 40 минут) при комнатной температуре. После этого образцы раскапывали в пробирки Эпендорфа и начинали замораживание в парах жидкого азота. Для этого замаркированные пробирки помещали на площадку, которая находилась в емкости с жидким азотом и «плавала» на его поверхности (рис. 1). Температура на поверхности пластины - -70 - -100°С. Время выдерживания образца в парах жидкого азота устанавливали экспериментально, после чего последний погружали в жидкий азот (t = -196°С). Вместе с тем апробировали способ сверхбыстрой заморозки спермы на тефлоновом планшете (рис. 3), которую помещали на поверхность жидкого азота в кювету. Сперму автоматическими пипетками раскапывали по гнездам пластины. Замороженные шарики ссыпали в емкость, объемом до 20 мл., которую помещали в жидкий азот.

Для проведения исследований влияния скоростей замораживания на качество и жизнестойкость образцов было необходимо осуществить калибровку температур в опытной камере. Рофиль распределения температур в зависимости от расстояния до поверхности жидкого азота приведен на рис. 2.

49

1

2

4

3

2

Рис. 1 Установка для замораживания образцов.

1 - емкость. 2 - жидкий азот. 3 - пенопластовая пластина на поверхности жидкого азота. 4 - замораживаемый образец.

Рис. 2. Профиль температуры в экспериментальной установке.

Размораживание образца осуществляли следующим образом. Быстрый вариант. Образец помещали под водяную баню, где температуру среды поддерживали 36-38°С. После оттаивания (время от 2 до 4 минут) замороженный образец помещали в базовый раствор для отмывки от криопротектора. Время отмывки для каждого вида осетровых рыб устанавливали отдельно.

Рис. 3. Планшет для быстрой заморозки образцов.

Рис. 4. Установка для замораживания спермы осетровых рыб.

За выходные показатели в экспериментах принимали время жизни сперматозоидов после оттаивания и отмывки протектора до полной их остановки, а также % подвижных спермиев в зоне видимости микроскопа. Третьим показателем являлся процент оплодотворения икры дефростированной спермой.

Статистическую обработку результатов осуществляли с применением приемов Теории планирования экспериментов. Использован план однофакторного блочного эксперимента с дисперсионным анализом. За факторы принимали образца криопротекторов, за блоки - сперму от разных самцов. Значимость различий между факторами и блоками устанавливали с применением F-критерия Фишера.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Перед началом эксперимента было необходимо проверить ряд параметров факторов. К таковым в первую очередь относятся: возможность криоконсервации спермы осетровых рыб любого качества и установление концентраций компонентов криопротекторов.

3.1. Оценка качества нативной спермы

Русский осетр. Нативную сперму русского осетра получили от 9 самцов путем сцеживания. Результаты оценки качества представлены в табл. 1

Таблица 1.

Оценка качества нативной спермы русского осетра.

№ самца	% подвижности	Время жизни
1	100	3.47
2	100	4.30
3	100	5,30
4	100	6,53
5	100	4.40
6.	100	6.39
7	100	3.37
8	100	3.14
9	100	7.27
Уср.	100	4.9

Примечание: N = 9. М = 4.9, . m = ±0.42.

После статистической обработки вариационного ряда оказалось, что по своим показателям сперма от разных самцов русского осетра достоверно не отличается друг от друга, Ошибка измерения составила m = ±0.42, что свидетельствует о незначительном разбросе показателей. Последнее свидетельствует, что можно замораживать сперму всех самцов. В среднем количество подвижных спермиев составило 100% во всех пробах, среднее время их жизни - 4.9 минуты, что соответствует рыбоводным нормативам (3 минуты). Для глубокой заморозки отобраны пробы самцов №№ 1- 6.

Севрюга. Получена сперма от 6-ти самцов. Седьмая проба состояла из смеси спермы от разных производителей. Результаты оценки качества приведены в таблице 2.

После статистической обработки вариационных рядов оказалось, что сперма севрюги от разных самцов достоверно отличается друг от друга. Поэтому криоконсервации отобраны образца спермы от самцов №№ 1, 3, 4, 6.

Таблица 2.

Оценка качества нативной спермы севрюги.

№ самца	% подвижности.	Время жизни
1	100	13.5
2	0	0
3	100	7.55
4	80	7.03
5	0	0
6	30	5.31
7	10	2.45
Уср.	45.7	5.11

Примечание: N = 7. % подвижности: М = 45.7, m = ±2.59,

время жизни: М = 5.11, m = ±0.86.

Впоследствии была получена сперма от самцов севрюги №№ с 9 по 19. Их оценка качества представлена в таблице 3.

Таблица 3.

Оценка качества нативной спермы севрюги.

№ самца	% подвижности.	Время жизни
8	100	2.52
9	60	1.43
10	100	3.35
11	80	1.29
12	60	1.20
13-18	0	0
19	50	1.36
Уср.	64.3	1.6

Примечание: N = 7. % подвижности М = 64.3, m = ±1.9

время жизни М = 1.6, m = ±0.4.

После статистической обработки данных и их анализа установлено, что этот материал не пригоден для глубокой заморозки в жидком азоте, так как в основной массе по всем показателям данный материал не отвечает рыбоводным показателям. Если же принять во внимание ожидаемое ухудшение качества спермы по принятым показателям (% подвижных сперматозоидов и время жизни спермиев), то после температурного шока (криоконсервации) такая сперма вряд ли может демонстрировать положительные свойства при оплодотворении. Поэтому принято решение данный биологический материал исключить из эксперимента.

3.2. Подбор оптимальных концентраций составляющих протекторов

Русский осетр. В качестве основных составляющих криопротекторы веществ являлись: глицерин, ДМСО, гепарин, сахароза, яичный желток и манит. За основной показатель для оценки концентрации апробируемых веществ принимали временя жизни сперматозоидов. Результаты тестирования приведены в табл. 4.

Таблица 4.

Результаты установления концентраций.

С	Глицерин	ДМСО	Гепарин
0.1мг/0.5млі	0	0.46	2.09
0.05мл3.	2.01	0	3.10
0.025 мл3.	-	2.02	-
0.025Х 3	Смесь 2.26

Для русского осетра были отобраны ряд вариантов криопротекторов, отличающихся друг от друга составом криопротектора №№ 1. 2. 3 и 4 и режимом заморозки-разморозки. Их различия были зашифрованы под следующими обозначениями: ОТ, БОТ, АБ и АС.

Для реализации эксперимента был использован однофакторный блочный тип планирования эксперимента (Адлер, 1969), где за блоки принимали сперму от разных самцов, а за факторы - варианты криопротекторов и режимы криоконсервации. За выходные показатели выбрали как время жизни сперматозоидов, так и % живых спермиев в опыте и контроле. Результаты эксперимента приведены в таблицах 5 - 8.

Таблица 5.

Однофакторный блочный эксперимент (% живых сперимев)

Блоки	ОТ	БОТ.	А.Б.	АС	1	2	3	4	К	Tj
1	23	0	0	2	6	10	7.5	15	100	163.5
2	2	0	2	5	7.5	12.5	5	7.5	100	141.5
3	2	0	0	5	17.5	32.5	10	5	100	158
4	5	5	3	5	5	15	10	17.5	100	165.5
5	60	20	5	5	15	10	12.5	5	100	232.5
6	10	5	0	3	10	10	10	5	100	153
Ti	102	30	10	25	61	90	55	55	600	1028

Статистическая обработка результатов

Корректирующий член ТШІ/N = 1028/54 = 19570, где N= 54.

SSобщ. = ??yiІ - TЦІ/N = 69250 - 19570 = 49680.

SSфак. = ?TiІ/n - К.Ч. = 43322 - 19570 = 23742, где n = 9.

SSбл. = ?TiІ/k - К.Ч. = 9859.

Ssош. = 49680 - (23742 + 9859) = 16079

Таблица 6.

Дисперсионный анализ

Различия	Степени свободы	Сумма квадратов	Средний квадрат
Между факт.	8	23742	2967
Между бл.	5	9859	1971
Ошибка	64	16079	251

F кр. Факторы = 2967 / 7750 = 11.8.

Fкр.бл. = 1971 / 7750 = 7.8

Таблица 7.

Однофакторный блочный эксперимент (время жизни спермы)

Бло ки	К	1	2	3	4	.ОТ	БОТ	АБ	АС	Tj
1	3.4	4.6	3.5	2.8	4.4	1	0	0	2.1	21.8
2	4.3	5.3	3.4	4.1	4.6	0.3	0	2.5	9.2	33.7
3	5.3	7.9	5.4	7.2	2.5	0.3	0	0	6.4	35
4	6.5	1.3	3.4	6.1	1.9	1.1	2.2	4.1	5.3	31.9
5	4.4	8.4	5.5	8.9	3.1	6.5	2	3.1	6.4	48.3
6	6.4	5.2	4.2	5.5	3.6	3.5	2.6	0	3.5	34.5
Ti	33	32.7	25.4	34.6	20.1	12.7	6.8	9.7	32.9	207.9

N = 54. n = 9. k = 6

Статистическая обработка результатов

К.Ч. TШІ/N = 800.4

SSобщ. = 2989.5 - 800.4 = 2189.1

SSфакт = 5630.3 : 9 - 800.4 = 625.6 - 800.4 = - 174.8

SSбл. = 1229.4 - 800.4 = 429.

SSош. = 2189.1 - (-174.8 + 429) = 1934.9

Таблица 8.

Дисперсионный анализ

Различия	Степени свободы	Сумма квадратов	Средний квадрат
Между факторами	8	174.8	21.9
Между блоками	5	429	85.8
Ошибка	64	1934.9	30.2

Страницы: 1, 2, 3